L'identification
de la séquence d'une protéine ou d'un peptide est réalisée
à l'aide du microséquenceur automatique Procise Protein Sequencing
System Model 494 connecté à un analyseur d'acides aminés-PTH
Model 140 de Perkin Elmer Applied Biosystems. Le procédé chimique
utilisé pour déterminer la séquence d'acides aminés
est basé sur la dégradation d'Edman.
Le microséquenceur est composé de 3 parties bien distinctes
(cartouches, chambre de conversion et colonne HPLC en phase inverse) dans
lesquelles se déroulent les différentes étapes de la
dégradation. La protéine d'intérêt est déposée
dans une des cartouches (1) où
débute la dégradation. Il s'y produit tout d'abord le couplage
de la protéine avec le PITC (PhénylIsoThiocyanate) dans des
conditions basiques pour former le dérivé PTC-protéine
(PnénylThioCarbamyl-protéine). Le TFA (l'acide TriFluoroAcetic)
clive ensuite le premier acide aminé sous forme de dérivé
acide aminé-ATZ (AnilinoThioZolinone) et libère l'extrémité
N-terminale pour le prochain cycle de dégradation. . L'acide aminé-ATZ
est ensuite transféré dans la chambre de conversion
(2) dans laquelle il est converti en acide aminé-PTH (PhenylThioHydantoin).
Cet acide aminé-PTH est injecté dans une colonne HPLC phase
inverse greffée en C18 (3) et détecté
à 269 nm. Son temps de rétention est alors comparé à
celui obtenu avec des acides aminés-PTH standard et ainsi de suite
pour les résidus acides aminés suivants résultant de
la dégradation. Il est à noter que des difficultés d'identification
surviennent avec les résidus tryptophane et cystèine qui sont
difficilement détectables. Néanmoins, un échantillon
de quantitè raisonnable (30 pmoles) permet de soupçonner la
présence de ces résidus dans une séquence.
Une fois la séquence déterminée, notre service réalise une recherche dans les bases de données par le biais des outils bio-informatiques.